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食品微生物检验方法框架

发布时间:2020-09-07 08:12 作者:人生就是博尊龙

  微生物学检验食品安全标准主要为GB 4789系列。截至2020年8月,现行有效的食品微生物检验共有除GB 4789.32、GB 4789.33、GB 4789.37外的GB 4789.14789.43共40个方法。此外,还有GB 8538-2016等产品类别中包括的微生物检验方法。各检验方法的标准均遵循一定的架构。

  GB 4789系列的食品微生物检验方法主要分为三种:一是常规培养法,绝大多数方法采用此方法;二是PCR(聚合酶链反应)法,如致泻大肠埃希氏菌检验(GB 4789.6)、诺 如 病 毒 检 验(GB 4789.42);三是免疫磁珠捕获法,如大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 检验(GB 4789.36)。

  对于常规培养法,无论是定性还是定量,都是对微生物细胞进行增殖的信号放大过程:对于定量检验来说,通过对微生物细胞的增殖,在固体琼脂上形成肉眼可见的菌落形成单位(CFU),或在液体培养基中形成肉眼可见的生物性浑浊,从而实现直接计数(平皿法或薄膜过滤法)或间接计数(最可能数法);对于定性检测来说,通过前增菌及选择性增菌,将目标微生物的数量逐渐放大,通过选择性平板分离检测和生化鉴定的识别,判定目标微生物检出与否。

  对于PCR法,其基本原理类似于DNA的天然复制过程,可在短时间内获得所需的大量的特定基因片段,通过后续电泳及成像技术或荧光检测技术对目标微生物的特定基因进行确认。

  对于免疫磁珠捕获法,是将针对特定致病微生物的多抗或单抗偶联到磁珠微球体上,将该修饰后的磁珠与待检样品的增菌液混合后,通过抗原抗体反应,与样品中可能存在的靶向微生物,形成磁珠目标微生物复合物。在外部磁力作用下,通过该复合物在磁场中的运动,将目标微生物从样品中分离出来,再通过选择性平板分离检测和生化鉴定的识别,判断目标微生物检出与否。

  此部分规定标准及其不同方法的适用范围。值得注意的是大肠菌群的检验方 法 GB/T 4789.3-2003 和 GB 4789.3-2016同时有效,应根据限度单位的要求选择方法,单位为MPN/100g(mL)选择前者,如生产日期在2019年12月21日前的酱油和食醋;其他选择后者。

  此部分为开展微生物检验所用的设备和材料,以及设备和材料的精度要求。实验室应根据相应的精度要求对设备进行检定和校准,必要时应用校准因子。值得注意的是,一般检验方法对恒温培养箱温度精度的要求是设定值 1℃,但克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验中mLST-Vm肉汤培养精度要求为设定值(44℃)0.5℃。同时应注意不同体积无菌吸管和微量移液器的精度要求。

  此部分为开展微生物检验所用的培养基和试剂,并在各自标准的附录中规定了培养基和试剂的成分及灭菌方法。培养基和试剂应严格按照GB 4789.28进行验收。鉴于培养基各组分稳定性的不同,准备培养基时应注意各培养基消毒灭菌方式及允许使用的保存时间,如GB 4789.3中的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA),GB 4789.4中的亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋(BS)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂,均不能灭菌,只需煮沸便可,后两者还规定宜于当天制备,第二天使用。因多数培养基为干粉状态,且个别培养基如亚硒酸盐胱氨酸(SC)培养基中的亚硒酸盐属剧毒品,在培养基的配制过程应采取避免接触性和吸入性危害的措施,如佩戴手套和口罩在通风橱中称量配制。

  定性检验的步骤通常包括(预)增菌、分离、鉴定、血清分型等。以沙门氏菌举例:预增菌的目的是让受损的微生物得以恢复,该步骤包括固态、液态及冷冻产品的前处理过程,以及对预增菌温度和时间的规定;增菌目的是选择性地促进目标菌的生长同时抑制非目标菌的生长。需要的注意的是,沙门氏菌有2500多种血清型,一种增菌液不可能适合所有沙门氏菌生长,因此沙门氏菌要同时用两种培养基增菌,其中SC更适合伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌增菌,最适增菌温度为36℃;TTB更适合其他沙门氏菌增菌,最适增菌温度为42℃。同理,分离步骤时,因不同分离平板对不同血清型的沙门氏菌分离选择性不同,标准要求选择两种平板进行分离。应严格按标准规定进行增菌和分离,不得擅自减少任何一种培养基或改变培养温度和培养时间,否则会导致漏检。

  定量检验的步骤相对简单,通常包括样品的稀释、培养和菌落计数。定量检验应格外注意称量、稀释和分液的准确性,以保证结果的有效性。除培养霉菌和酵母菌为正置培养外,其他项目如菌落总数、金黄色葡萄球菌等均为倒置培养。菌落计数时应将琼脂表面、内部及平皿周围的相应菌落全部点计在内。

  综合定性检验的结果报告样品中检出或未检出致病菌,结果单位除克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)单位为100 g(mL),其他均为25g(mL)。

  定量检验根据菌落计数结果结合相应计算方法报告定量检验的结果,单位为 CFU/g(mL)、MPN/100g(mL)或MPN/g(mL)。

  虽然食品微生物检验指标和方法并不多,但因为我国食品类别繁多,相同的微生物指标和方法在不同的食品基质中注意事项也不同。如同样是测定菌落总数,水产品因污染的微生物多数在偏低温度下存活和生长,其平板要求在30℃1℃培养72 h3 h,其他食品为36℃1℃培养48 h2 h。因此,标准起草单位在制定标准时尽量将食品基质考虑全面;生产企业应对自身产品的基质结合包装方式、货架期保存条件等可能影响微生物检测的因素进行全面研究;检验机构应严格按照法定标准进行检验,并不断积累经验和数据,保证结果的有效性,必要时提出标准修订的意见和建议。


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